茯苓药渣酶解工艺及其产物初步分析

作者：张年  通信作者：李顺祥

摘要：  目的 优化茯苓药渣酶解工艺，制备水溶性酶解产物，并初步分析酶解产物的结构。方法 通过Box-Behnken试验优化制备工艺，酶解产物经Sevage法脱蛋白，Sephadex G-75、DEAE Sepharose F F以及Sephadex G-50纯化，采用PMP柱前衍生-高效液相色谱法（HPLC）和高效凝胶渗透色谱-多角度激光光散射-示差折光联用（HPGPC-MALLS-RI）测定其单糖组成和分子量，刚果红实验检测三股螺旋结构的有无。结果 使用蜗牛酶，反应温度49 ℃，pH 6.2，反应时间34 h，酶用量2.6%，酶解得率达到36.97%左右，纯化后产物主要是由葡萄糖组成的低聚糖，由三个组分构成，重均分子量分别为1.739×10⁵、811.9、435.4，其中重均分子量为811.9的低聚糖为中性糖，占92.1%，是主要组成部分，纯化酶解产物不具有三股螺旋结构。结论 蜗牛酶适用于降解茯苓药渣，工艺稳定可行，所得产物得率较高，水溶性好，为进一步开发利用茯苓资源奠定了基础。

关键词：茯苓；酶水解；产物分析

Optimization of Enzymatic Preparation Process fromPoria cocos(Schw.) Wolf and its Products Analysis

ABSTRACT: OBJECTIVETo optimize the preparation process of water-soluble polysaccharides or oligosaccharide from Poria cocos (Schw.) Wolf and to preliminarily analyze the structure of enzymolysis products. METHODS  Box-Behnken design-response surface method was used to study the optimum preparation conditions. The protein was deproteinized by Sevage method, and the enzymolysis products was purified by Sephadex G-75, DEAE Sepharose F F and Sephadex G-50 column chromatography. The monosaccharide composition and molecular weight was determined by HPLC with PMP precolumn derivatization and HPGPC-MALLS-RI. The Congo red assay was used to detect the existence of three-stranded helical structures. RESULTS  Using snailase, with the optimum hydrolysis condition for Poria cocos enzymatic hydrolysis of 49 ℃, pH 6.2, 34 h, the enzyme dosage was 2.6%, the extraction rate of pachyman was about 36.97%. After purified, polysaccharide were main composed of glucose was made up of three components，which Mw was 1.739×10⁵, 811.9, and 435.4, and the oligosaccharide of the main component having Mw of 811.9 accounted for 92.1%. There was no triple helix structure existed in this fraction. CONCLUSION  The processing technology of selecting Snailase and hydrolyzing polysaccharides optimized by Box-Behnken design-response surface method has the advantages of stable and a new processing technology for water solubility enzymolysis products. which provides some ideas for the further development and utilization of poria cocos resources.

KEY WORDS:poria cocos; enzymatic hydrolysis; products analysis

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核，具有利水渗湿、健脾、宁心的功效^[1]，是药食两用大宗中药材。多糖类成分占茯苓菌核干重的80%以上^[2-3]，分为水溶性多糖和碱溶性多糖。水溶性多糖含量低，以杂多糖为主，而碱溶性多糖是茯苓中的主要多糖成分，含量可高达75%，主要是以β-(1→3)-糖苷键为主链，并伴有少量β-(1→6)-糖苷键分支的葡聚糖形式存在^[4-5]。但由于碱溶性多糖水溶性差，传统的中药煎煮方法不能将碱溶性糖有效煎出，对茯苓资源也是一种极大的浪费^[6]。为提高茯苓菌核的利用率，目前普遍采用化学方法进行结构改造。如切去茯苓多糖的β-(1→6)-糖苷键支链，仅留下β-(1→3)直链的葡聚糖，或采用羧甲基化、硫酸化、磷酸化、阿魏酸化等结构改造的方式，增强水溶性，提高抗肿瘤或免疫调节等活性^[7-12]。但化学方法存在溶剂残留和环境污染等风险，因此有必要采用其他途径提高茯苓菌核的利用率。

酶法降解具有环境友好、对设备要求不高、易于操作、特异性强、反应温和等优点，是一种理想的多糖降解方法^[13]。但酶的价格较高，为适用于工业化生产，必须优化酶解工艺，以期以最少的酶，获得最好的结果。目前有关酶法降解茯苓的报道较少且水溶性产物得率不高，获得多糖或低聚糖片段的组成及各片段活性尚不明确。因此，本课题优化茯苓酶解工艺制备水溶性酶解产物，为茯苓药渣的再利用提供参考；并对水溶性酶解产物进行分离纯化、结构分析，为茯苓资源的进一步开发利用提供理论基础。

1  仪器与材料

1.1 仪器

TU-1900型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SCIENTZ-10N冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；MS205DU电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；BS-100A自动部分收集器（上海泸西分析仪器厂有限公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。

1.2 材料与试剂

茯苓丁，湖南补天药业股份有限公司提供，经湖南中医药大学李顺祥教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核（样品保存于湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心，编号Fuling201701）。苯酚、无水乙醇、柠檬酸、柠檬酸钠、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、三氟乙酸（TFA）（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；D-无水葡萄糖对照品（批号：110833-201707）、鼠李糖对照品（批号：111683-201502）、D-木糖对照品（批号：111508-201605）均由中国食品药品检定研究院提供；硫酸（优级纯，株洲市星空化玻有限责任公司）；复合酶（Viscozyme L，100 FBG·g^-1）、复合酶（Utra FLO L）、复合酶（Celluclast 1.5 L，700 EGu·g-1）均由Novozymes公司提供；果胶酶（Pectinase from Aspergillus niger，1.0 units·mg^-1）、β-葡聚糖酶（Dextranase from Chaetomium erraticum）均由Sigma-Alorich公司提供；β-葡聚糖酶(50 U·mg^-1)、蜗牛酶（上海源叶生物科技有限公司）；DEAE Sepharose F F、Sephadex G-75、Sephadex G-50（美国GE公司）；牛血清白蛋白（上海源叶生物科技有限公司）；刚果红（上海麦克林公司）。

2 方法与结果

2.1 茯苓多糖含量测定方法

取D-无水葡萄糖标准品，精密称定，加纯化水溶解，定容，制成92.80 μg·mL^-1的溶液即得对照品溶液，参照中国药典（一部）铁皮石斛中多糖含量测定项下方法^[1]，绘制标准曲线并测定样品多糖含量，得标准曲线回归方程为A=0.01C-0.0041，R²=0.9995，测定多糖质量浓度线性范围是18.56 μg·mL^-1～ 92.80 μg·mL^-1。

酶解得率=测得多糖浓度×提取体积×稀释倍数÷茯苓样品重量×100%

2.2 水溶性酶解产物的制备

取1 kg干燥后茯苓丁粉碎成细粉，加80%乙醇回流脱脂，再加蒸馏水提取除去小分子糖和水溶性茯苓多糖，抽滤。滤渣于55 ℃干燥，粉碎过80目筛，得茯苓药渣粉即得研究样品。精密称取一定量茯苓药渣，加入10倍量含酶缓冲液，在适宜的温度和pH条件（不同比例的柠檬酸、磷酸氢二钠溶液）下酶解一定时间，取出，迅速放入100 ℃水浴10 min，使酶失活，冷却至室温后过滤，滤液浓缩至原体积的1/5，加5倍无水乙醇4 ℃放置24 h，离心取沉淀复溶，稀释到一定倍数，按苯酚-硫酸法进行糖含量测定，不加茯苓渣的含酶缓冲液同等条件处理作为空白对照。

2.3 不同酶对茯苓药渣酶解得率的影响

茯苓多糖糖苷键的主要类型是β-(1→3)-糖苷键，并伴有少量β-(1→6)-糖苷键分支^[14-15]，茯苓也含有结构为α-(1→3)-糖苷键的多糖^[16-17]。根据多糖的结构特点，拟选择Viscozyme L、Utra FLO L、Celluclast 1.5L、果胶酶Pectinase、葡聚糖酶Dextranase、β-葡聚糖酶、蜗牛酶这七种酶进行筛选。

在酶解温度为55 ℃，纯化水为溶剂，反应时间为2 h的酶解条件下，考察Viscozyme L、Utra FLO L、Celluclast 1.5L、Pectinase、Dextranase、β-葡聚糖酶、蜗牛酶这七种酶在用量均为2%时的酶解得率，结果如图1所示，由图1可知，蜗牛酶的酶解得率最大，因此选用蜗牛酶用于后续实验。

图1 酶种类对茯苓药渣酶解得率的影响

Fig.1 Effect of different enzymes on the yield of enzymatic hydrolysis

2.4 单因素实验考察茯苓药渣酶解工艺

取一定量茯苓药渣粉，按照“2.2”项下方法，采用水提醇沉法制备酶解产物。固定其他条件不变，分别考察反应温度（35、40、45、50、55、60 ℃）、反应时间（8、16、24、32、40、48 h）、pH(4、5、6、7、8、9)、酶用量（1、1.5、2、2.5、3、3.5%）对酶解得率的影响。结果如图2所示。

（a）

（b）

（c）

（d）

图2 不同酶解温度（a）、反应时间（b）、溶剂pH（c）和酶用量（%）对茯苓药渣酶解得率的影响（±s,n=3）

Fig.2 The results of single factor test on hydrolysis ofporia cocos by Snailase

2.5 Box-Behnken设计-响应面实验优化茯苓酶解工艺

在上述单因素试验基础上，选取反应温度（A）、pH（B）、反应时间（C）和酶用量（D）的四因素三水平进行实验设计，分别以-1、0、+1编码，因素与水平设计见表1。以茯苓多糖酶解得率作为预测响应值，按照响应面设计优化原理进行工艺优化筛选^[18-19]。实验设计及结果见表2。

采用Design Expert8.0.6软件分析表2数据，方差分析见表3，响应面结果见图3。回归方程为Y=-753.61292+27.45033A+ 15.04717 B +2.98431C+13.735D-0.017AB-0.012625AC+0.125AD+0.20719BC+ 3.39BD-0.10938CD-0.27693A²-2.42567B²-0.049053C²-7.12767D²。由表3可知，本模型回归系数R²=0.9770，P＜0.01，说明该模型回归极显著，同时模型的失拟项P=0.7854＞0.05，失拟项没有显著性差异，模型的实际值与预测值不拟合发生的概率低，模型良好，可用于茯苓多糖的实验设计。R_adj²=0.9539，∣R_adj²-R_pred²∣＜0.2进一步说明本模型设计合理。模型中因素A、C、BC、BD、A²、B²、C²、D²对茯苓药渣酶解得率的影响极显著性（P＜0.01），因素D对结果影响显著（P＜0.05）。4个因素对茯苓药渣酶解得率影响顺序为A＞C＞D＞B，即温度＞时间＞酶用量＞pH。响应面三维图和二维等高线图可直观地反应最优条件下各因素的取值和因素间交互作用的强弱。图3曲面图结果与表3方差分析结果相符。

软件优化出最佳条件为温度49.18 ℃，pH 6.22，时间34.31 h，酶用量2.61%，理论茯苓药渣最佳酶解得率为37.2858%。结合实际情况，便于实验操作，将各因素修正为温度49 ℃，pH 6.2，时间34 h，酶用量2.6%，进行验证试验，通过3次平行试验，得出实际酶解得率平均值为（36.97±0.54）%，与回归方程预测值37.2858%基本吻合，说明模型预测良好，所得结果准确可靠。随后取60 g茯苓药渣粉在最优的酶解条件下水提醇沉制备水溶性酶解产物，冷冻干燥得22.57 g茯苓药渣酶解产物。

表1 因素与水平设计

Tab 1Factors and levels of response surface experiments

水平

A 温度/℃

B pH

C 时间/h

D 酶用量/%

-1

45

5

24

2

0

50

6

32

2.5

+1

55

7

40

3

表2 Box-Behnken实验设计及结果

Tab 2Result and experiment design of Box-Behnken

编号

A 温度/℃

B pH

C 时间/h

D 酶用量/%

酶解得率/%

1

0

-1

-1

0

30.82

2

-1

0

-1

0

27.80

3

-1

0

1

0

30.16

4

0

1

1

0

34.84

5

0

0

1

-1

34.21

6

1

1

0

0

25.66

7

0

0

0

0

35.95

8

-1

1

0

0

29.74

9

0

0

-1

-1

29.10

10

1

0

0

-1

24.78

11

1

0

0

1

26.98

12

0

0

0

0

38.14

13

0

0

1

1

34.33

14

0

1

0

-1

30.42

15

0

1

0

1

34.80

16

0

0

0

0

37.50

17

-1

0

0

1

30.66

18

1

0

-1

0

23.95

19

-1

0

0

-1

29.71

20

0

0

-1

1

30.97

21

-1

-1

0

0

29.62

22

0

-1

1

0

30.72

23

1

0

1

0

24.29

24

0

0

0

0

35.63

25

0

1

-1

0

28.31

26

0

0

0

0

36.82

27

1

-1

0

0

25.88

28

0

-1

0

1

31.00

29

0

-1

0

-1

33.40

表3  回归模型方差分析

Tab 3ANOVA for response surface regression mode

来源

平方和

自由度

均方

F值

P值

模型

450.31

14

32.16

42.42

＜ 0.0001

A

56.99

1

56.99

75.15

＜ 0.0001

B

0.45

1

0.45

0.60

0.4527

C

25.81

1

25.81

34.04

＜ 0.0001

D

4.22

1

4.22

5.57

0.0333

AB

0.03

1

0.03

0.04

0.8480

AC

1.02

1

1.02

1.35

0.2655

AD

0.39

1

0.39

0.52

0.4847

BC

10.99

1

10.99

14.49

0.0019

BD

11.49

1

11.49

15.16

0.0016

CD

0.77

1

0.77

1.01

0.3320

A²

310.90

1

310.90

410.00

＜ 0.0001

B²

38.17

1

38.17

50.33

＜ 0.0001

C²

63.93

1

63.93

84.31

＜ 0.0001

D²

20.60

1

20.60

27.16

0.0001

残差

10.62

14

0.76

失拟项

6.24

10

0.62

0.57

0.7854

误差项

4.38

4

1.09

总离差

460.92

28

R²

0.9770

R_adj²

0.9539

R_pred²

0.9072

精密度

21.082

图3 温度、pH、时间、酶用量对茯苓药渣酶解得率交互影响的响应面及等高线

Fig.3 Response surface (3D) and contour showing effect of enzymolysis temperature、pH、time and enzyme quantity on the yield of enzymatic hydrolysis

2.6 水溶性茯苓酶解产物的纯化

将茯苓酶解产物配制成2%供试品溶液，经Sevage法脱蛋白，冷冻干燥。脱蛋白后样品配制成300 mg·mL^-1溶液，经Sephadex G-75柱层析初步分离纯化，苯酚硫酸法检测收集液，并绘制洗脱曲线（图4），部分褐色物质在10-23管洗脱出来，苯酚硫酸法检测发现褐色物质中糖含量极低，糖主要在28-44管洗脱出来，合并28-44管，冷冻干燥得灰白色絮状物，将其命名为PC。再将冻干样品加超纯水，配成20 mg·mL^-1溶液，经DEAE Sepharose F F柱层析进行再次分离纯化，分别以超纯水、0.1、0.3、0.5、1.0 mol·L^-1NaCl进行洗脱，利用部分自动收集器收集，苯酚硫酸法检测收集液，并绘制洗脱曲线（图5）。超纯水部分糖含量最大，另有少量糖在0.1 mol·L^-1、0.3 mol·L^-1 NaCl中洗脱出来。因此收集超纯水洗脱级份，冷冻干燥即得多糖PC-1，PC-1经Sephadex G-50柱层析完成第三次分离纯化，绘制洗脱曲线（图6），收集超纯水洗脱级份，冷冻干燥得白色蓬松絮状物PC-1-1。

图4 经Sephadex G-75凝胶柱分离的洗脱曲线

Fig.4 Elution profile of enzymatic hydrolysate on Sephadex G-75

图5 经Sepharose F F柱层析分离的洗脱曲线

（A：经超纯水洗脱；B：经0.1、0.3、0.5、1.0 mol·L^-1 NaCl洗脱）

Fig.5 Elution profile of the PC fraction on Sepharose F F through ultrapure water(A) and NaCl solution(B)

图6 经Sephadex G-50凝胶柱分离的洗脱曲线

Fig.6 Elution profile of the PC-1 fraction on Sephadex G-50

2.7 分子质量及分子半径测定与分析

采用高效凝胶渗透色谱-多角度激光光散射-示差折光联用（HPGPC-MALLS-RI）测定其分子量及分子半径^[20]。用Ohpak SB-805 HQ（300×8 mm），Ohpak SB-804 HQ（300×8 mm），Ohpak SB-803 HQ（300×8 mm）三柱串联使用，流动相为0.1 mol·L-1 NaNO3，流速0.4 mL·min-1，柱温45 ℃，采用Optilab T-rEX示差折光检测器与DAWN HELEOS Ⅱ多角度激光光散射检测器联用，利用ASTRA6.1软件处理数据，测定茯苓多糖PC-1-1的绝对分子量和分子半径，以样品的重均分子量和均方旋转半径做一条直线，其斜率可以对样品的空间构象进行表征。分子量结果及构象结果见表4、图7、图8。

表4 酶解产物PC-1-1的分子量测定结果及构象结果

Tab 4Molecular weight of PC-1-1

茯苓多糖酶解产物

组分1

组分2

组分3

保留时间(min)

36.286-46.925

71.000-74.000

76.216-77.678

Mw

1.739×10⁵

811.9

435.4

Mn

1.101×10⁵

743.1

366.3

Mw/Mn

1.579

1.093

1.189

质量分数/%

4.377

92.148

3.474

斜率

1.01±0.15

图7 酶解产物PC-1-1的HPGPC色谱图

Fig.7 HPGPC-RI-MALS chromatograms of PC-1-1

图8 酶解产物PC-1-1的空间构象图

Fig.8 Spatial conformational analysis of PC-1-1

样品PC-1-1在80 min前完成洗脱，80 min后为溶剂峰，HPGPC-MALLS-RI图谱蓝线是示差信号，主要反映浓度，红线是多角度激光光散射信号，主要反映分子量，综合两种检测器检出信号及软件ASTRA6.1的数据处理可进行如下判断：36.286 min～46.925 min处多角度激光光散射信号强，但示差信号极弱，可认为36.286 min～46.925 min位置有大分子物质，重均分子量为1.739×10⁵，，但含量极少，根据林先兵等^[21]对纯化多糖组分的分析，该大分子物质也存在是PC-1-1聚集体的可能；71 min～74 min处蓝线和红线重叠，出现一个左右对称峰，为PC-1-1的主要部分，重均分子量为811.9，质量分数依次为92.1%，为低聚糖。76.216 min～77.678 min处示差信号显示一个小峰，但多角度激光光散射信号很弱，可认为此处有一个量较少的低分子量成分，重均分子量为435.4，是低聚糖，质量分数为3.5%。构象结构图的斜率为1.01±0.15，说明分子在0.1 mol·L^-1 NaNO3溶液中呈棒状。

2.8 单糖组成测定与分析

采用柱前PMP衍生-高效液相色谱法对酶解产物PC-1-1的单糖组成进行测定^[22]。

样品PC-1-1完全酸水解：安瓿瓶中加入PC-1-1样品10 mg，2 mol·L^-1 TFA 2 mL，酒精喷灯加热封口，110 ℃水解6 h，降解完毕减压浓缩至干，加甲醇反复蒸干5次，除去TFA，用2 mL超纯水溶解得到完全酸水解样品。

PMP柱前衍生：取完全酸水解样品和混合对照品溶液200 μL置10 mL具塞试管中，依次加入0.5 mol·L^-1 PMP甲醇溶液200 μL和0.3 mol·L^-1 NaOH溶液200 μL，涡旋混30 s，70 ℃水浴避光加热60 min，冷却至室温，加0.3 mol·L-1 HCl 200 μL中和，加400 μL超纯水稀释混匀，加1 mL氯仿涡旋30 s，离心取上清液，氯仿重新萃取4次，上清液过滤膜，HPLC分析。

色谱条件：色谱柱为Supersil AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为pH 6.7 0.1 mol·L-1 磷酸盐缓冲液-乙腈（83:17）；柱温为30 ℃；流速为1 mL·min-1；检验波长为254 nm；进样量为10 μL。检测结果如图9所示，PC-1-1主要由葡萄糖组成。

图9 PC-1-1单糖组成的HPLC图谱

Fig.9 HPLC chromatograms of standard monosaccharides and monosaccharide composition

2.9 三股螺旋结构的检测

采用刚果红实验^[23]检测样品三股螺旋结构的有无。取2.0 mL 浓度为5 mg·mL-1的 PC-1-1样品溶液与2.0 mL 80 μmol·L^-1刚果红试剂混合，然后加入1 mol·L^-1 NaOH，使NaOH溶液终浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol·L^-1，室温下反应10 min，在400-600 nm范围内进行紫外光谱扫描，测得样品在各NaOH浓度条件下的最大吸收波长，另以纯化水代替样品溶液，加刚果红试剂和NaOH，同法扫描，以NaOH浓度为横坐标，最大吸收波长为纵坐标作图，结果如图10所示，随NaOH浓度增大，样品PC-1-1并未呈现三股螺旋结构所特有的特征性变化，表明PC-1-1没有三股螺旋结构。

图10 PC-1-1的刚果红实验结果

Fig.10 Congo-red assay of PC-1-1

3 结论与讨论

茯苓作为药食两用大宗中药材在我国食用已有几千年，年需求量大，随之产生的药渣量也较大。本实验以脱脂与除水溶性糖的茯苓药渣为原料，采用酶法制备水溶性产物，优化工艺条件，确定最佳的酶解条件为：温度49 ℃，pH 6.2，时间34 h，酶用量2.6%，此时水溶性产物得率达到（36.97±0.54）%，将茯苓药渣变废为宝，提高的茯苓资源的有效利用。研究发现酶解产物的主要部分是由葡萄糖为主组成的低聚糖，其重均分子量为811.9，有开发为功能性低聚糖的可能，有关酶解产物的生物活性将在后续实验研究完善后公布。

REFERENCES

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典.一部[S]. 北京:中国医药科技出版社, 2015: 241,283.

[2] Wang Y F, Zhang M, Ruan D, et al. Chemical components and molecular mass of six polysaccharides isolated from the sclerotium of Poria cocos[J]. Carbohydrate Research, 2004, 339(2):327-334.

[3] Li X , Ma L , Zhang L. Molecular basis for Poria cocos mushroom polysaccharide used as an antitumor drug in China[J]. Progress in molecular biology and translational science, 2019, 163:263-296.

[4] 胡国元,李伟伟,袁军,等.茯苓多糖的修饰技术及其构效关系研究进展[J]. 林产化学与工业, 2013, 33(05):121-126.

[5] 康廷国. 中药鉴定学[M]. 第4版. 北京:中国中医药出版社, 2016:385.

[6] 黄丹, 龚力民, 李兆星, 等. 基于功能成分发现的中药资源高效利用与可持续发展[J]. 世界科学技术-中医药现代化, 2017, 19(12):1984-1988.

[7] 李羿, 万德光, 刘忠荣, 等. 发酵茯苓菌丝体和天然茯苓多糖的研究[J]. 天然产物研究与开发, 2006, 18(04):667-669+673.

[8] Chen X Y, Xu X J, Zhang L N, et al. Chain conformation and anti-tumor activities of phosphorylated (1→3)-β-D-glucan from Poria cocos.[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 78 (3):581-587.

[9] 胡玉涛, 光明, 刘莹, 等. 茯苓全粉羧甲基化改性工艺研究[J]. 中草药, 2010, 41(12):1977-1981.

[10] 高贵珍, 吴超, 翟科峰, 等. 硫酸化茯苓多糖对人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的影响[J]. 基因组学与应用生物学, 2018, 37(05):2170-2174.

[11] Chen X Y, Zhang L N, Cheung P. Immunopotentiation and anti-tumor activity of carboxymethylated-sulfatedβ-(1→3)-D-glucan from Poria cocos[J].  International Immunopharmacology, 2010, 10(4):398-405.

[12] 陈小红, 马芳, 严云斌, 等. 茯苓多糖的结构改性及抗氧化活性研究[J]. 湖北农业科学, 2015, 54(18):4563-4566.

[13] 陈栋, 周永传. 酶法在中药提取中的应用和进展[J]. 中国中药杂志, 2007, 32(2):99-101.

[14] 张俐娜, 丁琼, 张平义, 等. 茯苓菌核多糖的分离与结构分析[J]. 高等学校化学学报, 1997, 18(6):990-993.

[15] Wang Y F, Zhang M, Ruan D, et al. Chemical components and molecular mass of six polysaccharides isolated from the sclerotium of Poria cocos[J]. Carbohydrate Research, 2004, 339(2):327-334.

[16] Jin Y, Zhang L N, Chen L, et al. Effect of culture media on the chemical and physicalcharacteristics of polysaccharides isolated fromPoria cocos mycelia[J]. Carbohydrate Research, 2003, 338(14):1507-1515.

[17] Huang Q L, Jin Y, Zhang L N, et al. Structure, molecular size and antitumor activities of polysaccharides from Poria cocos mycelia produced in fermenter[J]. Carbohydrate Polymers, 2007, 70(3):324-333.

[18] 宋燕, 冉姗, 孙方方, 等. Box-Behnken设计-响应面法优化木鳖子霜炮制工艺[J]. 中草药, 2019, 50(02):382-387.

[19] 余小翠, 刘高峰. 响应面分析法在中药提取和制备工艺中的应用[J]. 中药材, 2010, 33(10):1651-1655.

[20]  Zhang X, Zhao X L, Lang Y Z, et al. Low anticoagulant heparin oligosaccharides as inhibitors of BACE-1, the Alzheimer’s β-secretase [J]. Carbohydr Polym, 2016, 151(18): 51-59.

[21]  林先兵, 张旭锋, 王宇, 等. 细茎石斛中1种中性多糖的纯化与结构分析[J]. 中草药,   2018, 49(23):5516-5521.

[22]  顾菲菲, 李佳, 杨晨东, 等. 碱提灵芝多糖的分离纯化、结构表征及免疫活性评价[J]. 中草药, 2018,49 (10): 2359-2364.

[23] Rout D, Mondal S, Chakraborty I, et al. The structure and conformation of a water- insoluble (1→3)-,(1→6)-β-D-glucan from the fruiting bodies of Pleurotus florida[J]. Carbohydrate Research,2008, 343(5): 982- 987.